La micropipette : un super-biberon qui améliore le bien-être des animaux ?

Curiosité

Écriture : Caroline Lahogue
Relecture scientifique :
Ali-Kémal Aydin et Jean-Jacques Walker
Relecture de forme :
Louise Pinet et Lucile Rey

Temps de lecture : environ 15 minutes.
Thématiques :
Comportement animal (Biologie et Sciences cognitives)

Publication originale : Scarborough J., et al., Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain, behavior, and immunity, 2020. DOI : 10.1016/j.bbi.2020.04.015

Des notions POUR APPROFONDIR à la fin de l’article.

L’amélioration des méthodes appliquées aux animaux de laboratoire permet de réduire, soulager ou supprimer la détresse, l’inconfort ou la douleur de ces derniers. C’est dans l’optique d’améliorer les techniques d’administration et de réduire le stress lié à l’injection d’un médicament qu’une équipe de chercheur·ses de l’université de Zurich-Vetsuisse, en Suisse, a validé une nouvelle méthode orale d’administration qui utilise des micropipettes.

Quinze ans, c’est le temps le plus souvent nécessaire pour montrer qu’une molécule a bien un intérêt thérapeutique [1]. Pour arriver à une appellation de médicament et avoir une autorisation de mise sur le marché, les molécules thérapeutiques doivent passer une batterie de tests précliniques et cliniques. Au début, plus de mille molécules avec des caractéristiques très différentes les unes des autres sont découvertes. Les chercheur·ses caractérisent alors ces molécules afin de trouver lesquelles semblent les plus intéressantes. Seule une centaine de molécules passe la première étape et arrive à la deuxième, qui consiste à évaluer leurs effets en recherche préclinique.

La recherche préclinique concerne les projets menés à des fins scientifiques dans le but d’une meilleure compréhension des pathologies ou à des fins thérapeutiques en utilisant des animaux non-humains. Dans le cadre du développement d’un médicament, le code de Nuremberg de 1947 impose que tout traitement doit être au préalable testé chez des animaux avant d’être utilisé chez l’être humain. Ainsi, l’utilisation des animaux est nécessaire pour produire nos médicaments d’aujourd’hui (aussi bien ceux utilisés pour l’être humain que ceux utilisés pour les animaux eux-mêmes). Dans ce cadre là, les modèles animaux permettent d’évaluer les effets des médicaments candidats pour soigner les symptômes de certaines maladies. Un modèle animal est en effet un organisme dans lequel la maladie ou les symptômes se développent de manière similaire (en tout cas le plus similaire possible) à ce qu’il se produit chez l’être humain. Les modèles animaux permettent ainsi aux chercheur·ses de comprendre comment fonctionne l’organisme en question, aux niveaux cellulaire et moléculaire et de caractériser le comportement de l’animal. Ces modèles sont nombreux et peuvent être aussi bien des rats, souris ou lapin que des poissons. Le choix d’un modèle plutôt qu’un autre va dépendre de la question que se pose le/la chercheur·se.

Grâce à ces connaissances, les scientifiques évaluent ensuite le degré de toxicité, observent d’éventuels effets secondaires et surtout si la molécule a bien des effets bénéfiques en étudiant le comportement et la physiologie des animaux. Les modèles animaux permettent donc aux chercheur·ses d’observer les effets d’un médicament ou d’une molécule d’intérêt sur l’organisme vivant [2]. Une fois testées sur les modèles animaux, seules quelques molécules (moins de 10) seront retenues et testées cliniquement sur des volontaires sains et des patient·es. Et enfin, seul un médicament sera potentiellement accepté par les autorités sanitaires (Figure 1).

Flèche bleue qui pointe vers la droite. De gauche à droite, sur la flèche, est indiqué “10 000 molécules” avec en-dessous : “Découverte + caractérisation”. Puis : “
Figure 1. Étapes du développement d’un médicament. Le développement d’un médicament commence par le criblage et l’identification de plus de 10 000 molécules. Cette première étape permet de sélectionner les molécules les plus intéressantes et environ 250 molécules seront choisies et testées sur des modèles animaux. Cette deuxième étape permet de sélectionner les molécules les plus efficaces pour traiter certaines maladies. Si les molécules répondent aux différents critères définis par les scientifiques, elles pourront être testées en cliniques et, généralement, une seule sera réellement acceptée et mise sur le marché.

Aujourd’hui, l’expérimentation animale prend une place importante dans des domaines très divers (immunologie, neuroscience, pharmacologie, biochimie, cancérologie, etc.). Elle permet de mieux comprendre certains mécanismes physiologiques et pathologiques que d’autres modèles (comme les cellules cultivées dans des boîtes de Pétri ou les modèles informatiques) ne permettent pas forcément de saisir. Elle est particulièrement importante, comme nous venons de le voir, dans le développement de médicaments. Pourtant, cette utilisation d’animaux à des fins scientifiques soulève des questions éthiques et des réglementations sont de plus en plus strictement imposées aux chercheur·ses pour réduire la souffrance animale. En particulier, c’est lors de l’évaluation du projet de recherche par un comité d’éthique que ces questions sont abordées et discutées [pour approfondir : voir note A].

Vers un raffinement des techniques d’administration

Une étape importante lorsqu’on parle d’un modèle animal concerne sa validité prédictive. Elle signifie qu’une substance pharmacologique qui a des effets cliniques (chez l’humain) doit avoir des effets similaires sur le modèle animal en préclinique. Pour administrer une substance pharmacologique chez un modèle rongeur, plusieurs techniques classiques sont couramment utilisées. Le choix d’une technique dépend des caractéristiques du traitement :

  • la pharmacocinétique, c’est-à-dire l’étude du devenir du médicament dans l’organisme, son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et son élimination ;
  • la pharmacodynamique qui est la description des effets d’un médicament sur l’organisme. Cela comprend les effets thérapeutiques comme les effets indésirables ;
  • la solubilité dans l’eau, etc.

Les trois techniques les plus couramment utilisées sont (Figure 2) :

  • L’injection intra-péritonéale : cette technique consiste en l’injection de la substance pharmacologique, à l’aide d’une aiguille, dans le ventre de l’animal. Pour atteindre le ventre de l’animal, l’expérimentateur·rice réalise une contention de l’animal, c’est-à-dire bloque la souris de tout mouvement.
  • L’injection sous-cutanée : cette méthode nécessite de maintenir la souris sur le ventre afin de pincer doucement la peau de son dos et de la piquer avec la seringue pour administrer la solution.
  • Le gavage par voie orale : cette technique consiste à insérer une canule dans l’œsophage de l’animal afin de lui administrer le médicament par voie orale. Comme pour l’injection intra-péritonéale, elle nécessite une contention de la souris.
Trois souris de couleur marron sont représentées sur une ligne. La souris à gauche de la figure est allongée sur le dos et une seringue avec aiguille vient piquer au niveau du bas du ventre de celle-ci. Un texte en-dessous indique “Intra-péritonéale”. La souris au centre de l’image est positionnée sur ses quatre pattes, de profil. Une seringue avec aiguille vient la piquer au niveau du dos. Un texte en-dessous indique “Sous-cutanée”. La souris à droite est sur ses quatre pattes et une seringue avec une canule au bout est enfoncée dans sa gorge. Le texte en dessous indique “Gavage”.
Figure 2. Représentation schématique des trois techniques d’administration classiques en expérimentation animale.

Ces différentes techniques sont rapides à réaliser et permettent d’administrer une dose très précise du médicament. Elles nécessitent en amont une formation de l’expérimentateur·rice afin que les gestes techniques soient correctement réalisés. Ainsi, un·e expérimentateur·rice mal ou pas formé·e ou un geste qui n’est pas réalisé correctement entraîne très vite des biais et peut provoquer un stress voire une douleur chez les animaux. Aujourd’hui, la réglementation impose qu’un·e expérimentateur·rice qui manipule des animaux (rongeurs ou autre) suive des formations et apprenne à maîtriser les gestes techniques avant toute expérimentation. Outre le manque d’expérience des expérimentateur·rices, ces techniques peuvent entraîner d’autres problèmes. Des injections répétées avec les méthodes d’injection intra-péritonéale et sous-cutanée peuvent en effet conduire à des infections sur le site d’injection, et la technique du gavage peut causer des perforations de l’œsophage et de l’estomac. Il existe actuellement d’autres techniques alternatives, moins stressantes pour l’animal et plus facile à réaliser pour l’expérimentateur·rice. Par exemple, on peut ajouter la substance d’intérêt dans l’eau du biberon de la cage d’hébergement. Ces techniques semblent idéales, cependant elles ne permettent pas d’administrer une concentration précise du médicament, et il est nécessaire de refaire les solutions dès qu’on souhaite ajuster le dosage du traitement. De plus, les animaux sont hébergés au minimum par 2 et au maximum par 10 dans une cage, il est donc compliqué avec cette technique de savoir exactement la quantité de liquide que boit chaque animal d’une même cage.

Dans la publication scientifique que nous étudions ici, l’objectif de Scarborough et de ses collègues est de raffiner ces techniques et de développer une nouvelle méthode d’administration moins stressante : l’administration par voie orale guidée par micropipette (micropipette-guided drug administration). La validation de cette technique va permettre aux chercheur·ses d’utiliser en préclinique des techniques d’administration qui se rapprochent des techniques utilisées chez l’être humain.

Le modèle animal que l’équipe de Scarborough a décidé de choisir pour valider la technique est la souris. Scarborough compare ainsi la technique de la micropipette avec le gavage, l’autre technique d’administration par voie orale.

Principe de la technique de la micropipette

La figure représente une micropipette. La micropipette se compose d’une partie haute bleue avec une molette et un piston, et d’une partie plus fine blanche en bas de l’image avec au bout un cône jetable. On choisit d’abord un volume précis avec la molette. Ensuite, le piston permet d’aspirer ce volume de liquide dans le cône, et ensuite de le relâcher.
Figure 3 : Schéma représentant une micropipette avec son cône. La solution utilisée contient de l’eau distillée et du lait concentré sucré. La molécule d’intérêt peut être ajoutée et diluée dans cette solution.

La technique de la micropipette technique consiste à administrer à l’aide d’une micropipette une solution liquide légèrement sucrée, ici du lait concentré sucré, qui contient le médicament à tester (Figure 3). Le lait concentré sucré a été choisi pour motiver les souris à boire le contenu de la micropipette [pour approfondir : voir note B].

Dans un premier temps, une phase d’entraînement est nécessaire pour habituer les souris à boire à la micropipette. Elle se réalise en trois étapes. Le premier jour, l’expérimentateur·rice réalise une contention de la souris afin de lui apporter la micropipette à la bouche et délivrer la solution (Figure 4A). Le deuxième jour, la souris est posée sur la grille de sa cage, l’expérimentateur·rice maintient légèrement la souris par la queue et amène la micropipette afin de délivrer la solution (Figure 4B). Le dernier jour, la souris se déplace librement sur la grille ou dans sa cage et l’expérimentateur·rice approche la micropipette contenant la solution à boire de l’animal. La souris boit volontairement le contenu car elle s’attend à avoir du lait concentré sucré (Figure 4C).

La figure se compose de trois parties A, B et C. En A, une souris marron est maintenue sur le dos par la main gantée d’une personne. La micropipette est approchée de la bouche de la souris. En B, la même souris est positionnée sur une grille et est tenue par la queue par une main gantée. La partie plus fine de la micropipette avec le cône est approchée de la bouche de la souris. En C, la souris est représentée dans sa cage composée de deux parois grisâtres et d'un sol marron clair. La souris est debout sur ses deux pattes arrières et la micropipette est approchée de sa bouche.
Figure 4. Schéma représentant les différentes étapes d’entraînement à la méthode d’administration par micropipette. L’entraînement dure 3 jours, le premier jour (A) la souris est contentionnée, le deuxième jour (B) elle est tenue par la queue et le troisième jour (C) elle boit le contenu volontairement.

Afin d’évaluer l’effet de la méthode et de la valider, l’équipe de recherche a comparé la technique développée avec des contrôles négatif et positif. Le contrôle négatif est un groupe de souris qui n’ont reçu aucune manipulation expérimentale, et le contrôle positif est un groupe de souris traitées avec la méthode du gavage (Figure 2), méthode qui induit un stress chez les animaux [3]. Chez ces trois groupes de souris, plusieurs paramètres sont mesurés (Figure 5) :

  • Le poids des souris. Cette mesure permet de vérifier que la présence du lait concentré sucré ne provoque pas une augmentation du poids des souris. En effet, l’administration par le gavage ne nécessite pas l’ajout du lait concentré sucré et la prise de poids pourrait modifier la physiologie de l’animal.
  • La concentration plasmatique en corticostérone. On appelle corticostérone l’hormone du stress car une augmentation de cette dernière est observée dans les situations stressantes. L’hormone équivalente chez l’humain s’appelle le cortisol. La mesure de la concentration en corticostérone est réalisée plusieurs fois pour les trois groupes (contrôle négatif, micropipette et gavage ; Figure 5) et permet d’évaluer l’état de stress des animaux tout au long de l’expérience.
  • Le profil pharmacocinétique de la rispéridone. Ce neuroleptique [*] est ajouté par les auteur·rices dans la solution pour observer, par dosage, le profil pharmacocinétique de ce médicament [4]. Cette partie sert à observer si la méthode d’administration à un impact sur les effets du médicament. En effet, l’utilisation d’un médicament permet de comparer l’assimilation de la molécule entre les deux techniques.

Ces mesures sont faites au cours d’une phase de 6 jours consécutifs correspondant à une phase d’attente pour les souris contrôle négatif, ou une phase d’habituation aux différentes techniques pour les autres groupes. Lors d’une habituation, les souris sont respectivement habituées aux différents gestes, soit au gavage (placer la sonde, contentionner l’animal), soit à boire à la micropipette. La solution donnée durant cette phase d’habituation ne contient qu’une solution sucrée sans rispéridone. Ce n’est que le 7e jour que la rispéridone est ajoutée dans la solution de la micropipette et du gavage (Figure 5).

Flèche bleue qui pointe vers la droite. À gauche de cette flèche est représentée une souris marron, de face, avec les indications “Souris mâles”, et “ ge : 10-12 semaines”. Au-dessus de la flèche, plusieurs indications temporelles sont précisées, allant du J1 (jour 1) à J7. À partir du J1, trois rectangles sont représentés en dessous de la flèche pour illustrer le déroulement de l’habituation de chacune des techniques. Le premier est jaune et va de J1 à J3 pour représenter la phase d’entrainement à la micropipette, et de J3 à J6 pour représenter la phase d’habituation à la micropipette. Le deuxième rectangle est vert et va de J1 à J6 pour représenter la phase d’habituation au gavage. Le troisième rectangle est en bleu, et va de J1 à J6 pour aucun traitement. Une illustration de chaque technique est représentée à gauche des rectangles ainsi qu’une image d’une souris à droite de la flèche à J7. Aux J1, J2, J3 et J7, une petite goutte rouge est représentée sur la flèche temporelle bleue pour indiquer le dosage plasmatique de la corticostérone. En plus, à J7, une petite boite de médicament noire est schématiquement représentée pour indiquer le dosage plasmatique de la rispéridone. Les légendes de ces dosages sont représentés juste au-dessus de la flèche bleue.
Figure 5. Chronologie des expérimentations. Les souris mâles sont âgées de 10-12 semaines et sont réparties en trois groupes : les souris traitées avec la méthode de la micropipette (jaune) et les souris traitées avec la méthode du gavage (contrôle positif, vert) et le groupe contrôle négatif non traité (bleu). Afin de comparer les trois techniques entre elles, l’équipe de Scarborough dose l’hormone du stress, la corticostérone, et/ou la molécule active d’intérêt, la rispéridone, sur plusieurs jours : durant les trois premiers jours correspondant à la phase d’entraînement de la technique de la micropipette, puis à la fin de l’habituation des différentes techniques (le 7e jour). Des dosages plasmatiques de la corticostérone sont réalisés sur tous les groupes les trois premiers jours d’administration. Le 7e jour, le dosage plasmatique de la rispéridone et de la corticostérone est réalisé dans tous les groupes. Crédit : pictogrammes BioRender, usage pédagogique.

Pour tester s’il existe des différences entre les trois groupes testés, les auteur·rices utilisent un modèle statistique qui est l’analyse de la variance (ANOVA) suivie par des tests de Tukey. Il permet d’obtenir une valeur qu’on nomme p-value ou p que l’on va comparer à un seuil de significativité qui est habituellement fixé au seuil de risque de 5 % (soit 0,05) :

  • Si la p-value est supérieure ou égale à 0,05 : on considère qu’il n’y a pas d’effet du facteur sur la variable d’intérêt. Aucune différence.
  • Si la p-value est inférieure à 0,05 : on considère qu’il y a un effet du facteur sur la variable d’intérêt. Des différences significatives ont été trouvées.

Dans cet article, le facteur est le traitement utilisé (3 groupes : sans traitement, gavage ou micropipette) : les auteur·rices veulent voir si le traitement influence la concentration plasmatique en corticostérone (la variable d’intérêt). Avec ce modèle, les auteur·rices peuvent savoir entre quels groupes il y a une différence et le représenter sur les graphiques. Ainsi si la p-value est inférieure à 0,05 le symbole « * » sera présent sur le graphique. Si la p-value est encore plus petite, inférieure à 0,01, il faut rajouter un deuxième symbole, « ** », afin de montrer que la différence entre les groupes est encore plus importante [pour approfondir : voir note C].

Nouvelle technique plus simple, plus rapide, moins stressante ?

Les résultats de l’article indiquent que, malgré la présence de sucre dans la solution de la micropipette, la méthode n’influence pas le poids des souris. Il reste stable et identique au groupe contrôle, sans traitement, signifiant que le lait concentré sucré présent dans la solution n’a aucune influence sur le poids des souris (Figure 6). Les auteur·rices expliquent également que la présence de ce goût sucré dans la solution n’a aucune influence sur la consommation (aucun effet addictif ou réversif). Aucune souris n’a cessé de boire à la pipette.

Schéma représentant, sur l’axe des ordonnées, la masse des souris (en gramme) allant de 0 à 30 g, en fonction de l’âge des souris sur l’axe des abscisses (en semaine) allant de 8 à 13 semaines. Deux courbes sont représentées, l’une en bleue indique le groupe sans traitement et l’autre en jaune indique la méthode de la micropipette. Les deux courbes sont superposables. Elles démarrent à 8 semaines à environ 23 g et à 13 semaines la masse des souris est d’environ 30g. À 10 semaines, il est indiqué le début de l'entraînement des souris par une ligne verticale pointillée.
Figure 6. Évolution de la masse des souris au cours du temps. Aucune différence n’est observée entre les deux groupes, non traité et traité à l’aide de la micropipette. Le poids des souris est similaire entre ces deux groupes. Profil de résultat.

Les chercheur·ses montrent également que la concentration de l’hormone du stress (corticostérone) n’est pas différente entre le groupe contrôle négatif (sans traitement) et le groupe avec la micropipette (Figure 7, courbes jaune et bleue). Ce résultat suggère que dès le premier jour d’entraînement avec la micropipette, cette technique n’est pas ou très peu stressante. Concernant le gavage, les scientifiques montrent que la concentration en corticostérone, après six jours d’habituation, est trois fois plus élevée que celle des deux autres groupes (Figure 7, courbe verte). Ce résultat montre que malgré une habituation de six jours, le gavage reste un acte davantage stressant pour l’animal.

Schéma représentant la concentration en Corticostérone plasmatique sur l’axe des ordonnées (profil du résultat en ng/ml) en fonction du temps sur l’axe des abscisses (en jour avec quatre points marqués : J1, J2, J3 et J7). Trois courbes sont représentées. Une courbe bleue, correspondant au groupe non traité, varie très peu et reste stable autour de 100 ng/ml. Une courbe jaune, correspondant au groupe micropipette, commence autour de 150 ng/ml et diminue pour arriver vers 100 ng/ml à J7. Et la dernière courbe, verte, correspondant au gavage, commence autour de 300 ng/ml à J1 puis diminue légèrement pour être autour de 280 ng/ml à J7. Deux accolades, l’une entre les courbes micropipette et gavage et l’autre entre les courbes non traité et gavage, sont représentées sur la droite du graphique avec deux étoiles “**” indiquant une différence statistique significative entre les groupes.
Figure 7. Effet des différentes méthodes d’administration (micropipette et gavage) sur la concentration plasmatique en corticostérone. Le graphique présente l’évolution au cours du temps de la concentration plasmatique lors des trois jours d’habituation de la micropipette et lors du jour 7 en comparaison avec le groupe non traité et le gavage. Aucune différence significative n’est observée entre le groupe non traité et le groupe traité avec la méthode de la micropipette. Une forte augmentation de la concentration en corticostérone est observée dans le groupe gavage, où elle est significativement supérieure aux deux autres groupes. Comparaison de groupe avec une ANOVA suivi du test de Tukey : **p-value<0.01. Profil de résultat.

Enfin, le profil pharmacocinétique de la rispéridone est identique entre la méthode du gavage et celle de la micropipette. Dans ces deux cas, la rispéridone est donc très rapidement absorbée. L’absorption est un processus par lequel une substance est absorbée dans le sang pour ensuite être délivrée au reste du corps. De plus, le profil pharmacocinétique trouvé correspond aux études réalisées chez l’humain [4].

La technique de la micropipette est-elle validée ?

Au vu des premiers résultats de Scarborough et de ses collègues, la technique d’administration à l’aide d’une micropipette semble être une nouvelle méthode d’administration prometteuse et non invasive (moins de stress, facilité de réalisation, pas de perte de poids [**], etc.). Cette méthode d’administration peut soulever tout de même quelques questions, et doit être adaptée en fonction de la recherche qui est engagée.

En effet, cette technique nécessite plus de temps que les autres. Par rapport aux techniques plus classiques (gavage et injection intrapéritonéale), la méthode par la micropipette requiert trois jours d’habituation, ce qui peut être un frein et rallonger les manipulations. Cependant, le fait de laisser les souris sur la grille de leur cage ou directement dans leur cage permet, lors de l’administration du médicament avec une micropipette, de diminuer significativement le stress de l’animal. Une technique plus invasive comme le gavage provoque un stress important chez les souris et ce même 30 minutes après l’injection, ce qui peut éventuellement influencer les résultats des tests qui seront faits juste après l’administration. Faut-il alors gagner du temps et utiliser des techniques classiques (gavage et intrapéritonéale) afin de ne pas rallonger les manipulations, ou faut-il prendre le temps d’habituer les animaux à une technique moins stressante ?

Une autre question se pose : est-ce que cette technique est adaptée à tous les médicaments ? Certaines substances ne sont pas administrables par voie orale notamment à cause du suc gastrique qui peut les dégrader. Dans ces cas, seule l’injection intrapéritonéale est adaptée. Il faut donc pouvoir adapter la méthode d’administration à la substance étudiée.

Cette technique est-elle adaptée pour un traitement chronique ? Dans cet article, les auteur·rices ont testé la méthode sur sept jours, et ils et elles expliquent qu’aucune souris n’a abandonné en cours de route puisqu’elles ont continué à boire le contenu de la pipette. L’équipe de recherche a également testé la méthode sur des souris plus jeunes, âgées de 21 jours (ce qui correspond à un jeune adulte chez l’être humain). Ils disent n’avoir vu aucune différence dans la consommation de la solution sucrée par rapport à des souris plus vieilles (résultats non montrés dans la publication originale). Cette technique serait ainsi adaptée aussi bien à des souris juvéniles qu’à des souris plus âgées, ce qui est intéressant pour des études qui nécessitent de jeunes souris, par exemple pour la recherche sur le développement. Cette méthode de la micropipette présente donc des avantages comme des inconvénients. Il faut pouvoir l’adapter à la substance utilisée en fonction de ses propriétés.

Conclusion

La technique de la micropipette est une nouvelle méthode alternative qui semble plus respectueuse des animaux que celles utilisées jusqu’alors. Elle est moins stressante, non invasive et sa mise en place est facile. Un ou une expérimentateur·rice peu habitué·e peut facilement se l’approprier. Par rapport à d’autres techniques non invasives, cette méthode permet l’ajustement du volume d’administration et de la concentration du médicament en fonction du poids de l’animal. Cette méthode, décrite par l’équipe de Scarborough, permet de raffiner les techniques d’administration actuelles et semble ainsi prometteuse. Il faut cependant pouvoir l’adapter à d’autres espèces et tester d’autres molécules/médicaments plus ou moins solubles dans l’eau et plus ou moins amères afin de voir les limites de cette nouvelle méthode d’administration.

Éléments pour approfondir

Note A

La règle des 3R – Remplacer, Réduire et Raffiner. Publié dans le livre The principles of Human Experimental Technique en 1959, le concept de la règle des 3R : Remplacer, Réduire et Raffiner (en anglais replacement, reduction, and refinement), a été mis en place par W.M.S. Russel et R.L. Burch [5]. Cette règle a pour but de faire réfléchir l’ensemble des personnels de recherche sur leurs propres procédures et expérimentations, afin de les optimiser en prenant en compte le bien-être animal. Il s’agit de la première règle qui décrit l’animal comme étant un être sensible. Depuis, des directives européennes, celle de 1986 (86/609/CE) abrogée en 2013 puis celle de 2010 (2010/63/EU) appliquée en France depuis 2013, soumettent les établissements utilisateurs d’animaux à respecter le bien-être animal et à prendre en considération cette règle des 3R :

  • Réduire : diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles de recherche. L’utilisation des mêmes animaux pour plusieurs études, lorsque cela est possible, est conseillée. Cependant cette règle a des limites. La répétition d’expériences chez un même animal peut causer davantage de souffrance et de stress. Il est donc important de trouver un équilibre dans les expérimentations entre le nombre d’animaux nécessaire et leur bien-être.
  • Remplacer : trouver des alternatives à l’expérimentation animale. Il est conseillé, par exemple, d’utiliser des modèles in vitro (culture cellulaire par exemple) ou des modèles in silico (modèles informatiques). Cette règle ne peut pas s’appliquer à tous les projets. En effet, le développement de médicaments entre autres, nécessite l’utilisation des animaux et cette procédure ne peut pas être remplacée. Il est essentiel, si le médicament doit soigner les symptômes d’une maladie, d’observer comment les animaux se comportent après l’injection de la molécule. Cela permet de voir les effets du médicament sur le comportement ou la physiologie d’un être vivant, phénomènes qui sont très compliqués à observer avec les techniques alternatives.
  • Raffiner : optimiser au mieux l’environnement dans lequel se trouvent les animaux pour réduire toute forme d’inconfort et de mal-être. Cette optimisation va de l’hébergement et l’enrichissement des cages (par exemple rajouter dans les cages du papier craft ou du coton pour faire des nids, des tunnels, une roue pour faire de l’exercice, ou encore des petits bâtonnets de bois pour ronger), à la formation des expérimentateur·rices et l’amélioration des protocoles et des méthodes comme les techniques d’administration.

Aujourd’hui, deux autres R peuvent être rajoutés : responsabiliser, notamment le personnel de recherche, et réhabiliter, c’est-à-dire donner une seconde chance à ces animaux en les faisant adopter par des familles d’accueil ou des associations. Ces règles sont apprises tout au long de la formation et de la carrière des chercheurs. En effet, selon la réglementation, toute personne qui utilise des animaux à des fins scientifiques doit réaliser des formations continues. Ces formations représentent l’équivalent de 3 jours sur une période de 6 ans afin de maintenir les compétences (Arrêté du 01/01/2013 du Ministère de l’Agriculture et de l’Agroalimentaire).

Note B

Pourquoi ajouter du lait concentré sucré ? Cet ajout d’une solution sucrée est très appétant pour les rongeurs et peut masquer le goût amer voire aversif de certaines substances pharmacologiques. Ainsi, à l’aide de l’ajout d’une solution sucrée, les souris arrivent très rapidement à boire le contenu de la pipette (en quelques secondes) et de manière volontaire.

Note C

Les tests statistiques. Avec l’ANOVA, les moyennes de chaque groupe d’un même facteur sont comparées globalement, le résultat du test indiquant s’il existe au moins deux groupes dont les moyennes sont différentes, autrement dit, s’il y a un effet du facteur sur une variable que l’on nommera variable d’intérêt. Ce test est réalisé si et seulement si toutes les conditions suivantes sont réunies : données réparties selon la loi Normale (gaussienne), homoscédasticité des valeurs et données indépendantes (pour plus d’information : Méthodologie scientifique).

Dans le cas où l’ANOVA détecte une différence, pour savoir où cette différence se situe, c’est à dire entre quels groupes, les chercheurs doivent réaliser d’autres tests dans lesquels les moyennes sont comparées deux à deux. Ces tests sont appelés post-hoc (du latin post hoc, qui signifie « à la suite de cela »). Il s’agit ici du test de Tukey. Comme pour l’ANOVA, on obtient une p-value que l’on compare au seuil de significativité.


[*] Médicament utilisé dans le cadre d’une maladie psychiatrique comme la schizophrénie. Il agit sur les symptômes de la maladie.

[**] Une perte de poids trop importante est signe d’un stress ou mal être chez les animaux.


[1] Inserm, « Développement du médicament ⋅ Inserm, La science pour la santé », 2017. [Ressource pédagogique]

[2] Koszła O., et al., In Vitro and In Vivo Models for the Investigation of Potential Drugs Against Schizophrenia. Biomolecules, 2020. DOI : 10.3390/biom10010160. [Review]

[3] Arantes-Rodrigues R., et al., The effects of repeated oral gavage on the health of male CD-1 mice. Lab Animal, 2012. DOI : 10.1038/laban0512-129. [Publication scientifique]

[4] Mannens G., et al., Absorption, metabolism, and excretion of risperidone in humans. Drug Metabolim and Disposition, 1993. PMID : 7507814 [Publication scientifique]

[5] Russell W.M.S. & Burch R.L., The principles of humane experimental technique. Wheathampstead (UK): Universities Federation for Animal Welfare, 1959 ; special edition 1992. [Livre de science]


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