Comment montrer que « la mutation précède la sélection » avec une poignée de virus et de bactéries : l’expérience de Luria et Delbrück (Curiosité)

Publication historique

Écriture : Irène Tanneur
Relecture de contenu : Maud Billaud et Bastien Mallein
Relecture de forme : Guillaume Witz et Carlotta Figliola

Temps de lecture : environ 10 minutes.
Thématiques : Évolution, Génétique et Microbiologie (Biologie)

Publication originale : Luria S. E. & Delbrück M., Mutations of Bacteria from Virus Sensitivity to Virus Resistance. Genetics, 1943.

Version approfondissement

Photographie en microscopie électronique à transmission de bactériophages à la surface d’une bactérie. Grossissement d’environ x200 000. Crédit : Dr Graham Beards/Wikimedia Commons/CC BY-SA 3.0

En 1943, les connaissances sur l’hérédité ou la sélection et en particulier leurs bases génétiques n’en sont qu’à leurs balbutiements. Des questions fondamentales restent ouvertes, par exemple : comment les caractères héréditaires apparaissent-ils ? Est-ce que la pression de sélection joue un rôle dans l’hérédité ? À l’aide d’expériences de sélection sur des bactéries infectées par des phages (des virus bactériens), deux chercheurs, Max Delbrück et Salvador Luria, vont répondre à ces questions alors que le mécanisme biologique sous-jacent — les mutations de l’ADN — est encore inconnu.

L’étude des « virus bactériens » soulève des questions

Les virus sont des organismes contenant des acides nucléiques, les longues molécules portant l’information génétique (comme l’ADN). Ils doivent obligatoirement infecter une cellule pour reproduire leur matériel génétique. Si le mot « virus » peut vous évoquer des maladies humaines, par exemple la grippe dont le virus infecte des cellules humaines, les bactéries aussi peuvent aussi être infectées par des virus. Ceux-ci, découverts au début du XXe siècle, sont appelés bactériophages ou tout simplement phages.

En microbiologie, une technique de routine parmi les plus simples et les plus essentielles est la culture des bactéries. Elle peut se faire dans un liquide ou sur un solide. Dans le premier cas, il s’agit de placer quelques bactéries dans un liquide contenant tous les nutriments nécessaires à leur croissance ; souvent, cette technique est effectuée en tube à essai. Les bactéries vont utiliser les nutriments pour croître et se diviser, donnant naissance à de nouvelles bactéries et ainsi de suite. Plus il y a de bactéries dans une culture, plus elle va être turbide, c’est-à-dire trouble (Figure 1). Puisque la quantité de nutriments pour les bactéries est limitée, une culture ne peut contenir qu’un nombre limité de bactéries : quand ce nombre est atteint, on dit que la culture est à saturation.

Figure 1. Deux flasques contenant une culture bactérienne après une nuit d’incubation (à gauche) et du milieu sans bactéries (à droite). On observe à gauche que la culture est devenue trouble. Crédit : Joseph Elsbernd/CC BY 2.0.

Ajoutez un peu de gélifiant à cette nourriture à bactéries, versez le tout dans une boîte, et vous pouvez les faire pousser, c’est-à-dire les faire croître sur un milieu solide. Cela permet, lorsque le nombre de cellules est assez petit, de séparer spatialement les bactéries les unes des autres et d’observer des clones : des ensemble de bactéries toutes issues d’un même ancêtre, facilement repérables sur le milieu solide (Figure 2).

Figure 2. Des bactéries de l’espèce Escherichia coli sur un milieu solide. Chaque point blanc isolé correspond à une colonie bactérienne : des bactéries toutes issues d’un même ancêtre. Compter ces points revient à connaître le nombre initial de bactéries placées sur le milieu de culture solide.

Maintenant, si vous placez des phages dans une culture liquide de bactéries à saturation, vous observerez que la culture s’éclaircit. C’est parce que les phages ont lysé les bactéries : en d’autres termes, ils les ont tuées. Néanmoins, après quelque temps, la culture redevient turbide ! Cela signifie que certaines bactéries n’ont pas été lysées par les phages et ont recommencé à croître et à se diviser dans le milieu de culture. On dit alors que ces bactéries sont résistantes au phage, et qu’elles ont été sélectionnées : contrairement aux autres bactéries, elles sont adaptées au milieu contenant des phages. La sélection est le processus grâce auquel les organismes les plus aptes à survivre dans un environnement vont y devenir prédominants.

Mais quand ces bactéries deviennent-elles résistantes au phage ? Avant ou après l’ajout des phages à la culture ? En 1943, certains scientifiques pensent que la résistance héréditaire arrive grâce à l’action du phage, et donc qu’aucune bactérie ne peut être résistante avant l’ajout du phage. Pour d’autres, la résistance est apparue par hasard avant cet ajout. Le débat se divise donc entre deux hypothèses. Selon la première, la résistance des bactéries est acquise en réponse à la présence du phage ; selon la seconde, une mutation — une modification de la séquence d’ADN de la bactérie qui empêche le phage de l’infecter ou de la lyser — apparaît tout d’abord, et cette mutation précèderait la sélection.

Ces questions ne concernent pas que les bactéries et les phages, mais s’inscrivent dans un débat plus large sur l’évolution et le rôle de la sélection : est-ce que, soumis à une sélection, les êtres vivants changent pour s’adapter à cette sélection, ou bien est-ce que la sélection ne fait que mettre en avant les êtres qui y étaient déjà adaptés auparavant, en éliminant les autres ?

La grande loterie des mutations

Luria et Delbrück prennent pour point de départ les observations effectuées sur les bactéries et les phages pour tenter de trancher. Ils nomment la première théorie l’hypothèse d’immunité héréditaire acquise, et la seconde l’hypothèse mutationnelle. Pour vérifier laquelle décrit le mieux les expériences menées avec des bactéries et des phages, ils s’interrogent sur le nombre de bactéries résistantes attendues dans une culture infectée par des phages selon chacune des deux hypothèses.

Selon l’hypothèse d’immunité acquise, avant l’infection, certaines bactéries seraient capables de résister au phage, mais pas de transmettre cette résistance à leur descendance ; c’est l’interaction avec le phage qui rendrait la résistance au phage héréditaire, c’est-à-dire transmissible à toutes les bactéries issues de cette bactérie « mère ». Donc, dans ce premier cas, si l’on fait pousser des bactéries dans plusieurs cultures séparées, les proportions de bactéries résistantes suite à une infection devraient être semblables d’une culture à l’autre. 

Selon l’hypothèse mutationnelle en revanche, la bactérie a une faible chance de devenir spontanément et par hasard résistante, et elle transmettra cette résistance à toute sa descendance, y compris en l’absence de contact avec le phage. Là, en fonction du moment où a eu lieu la mutation, le nombre de mutants d’une culture à l’autre devrait donc être très variable. Si elle a lieu tôt dans la culture — ce qui est peu probable car il y a alors peu de bactéries — il y aura un grand nombre de bactéries résistantes car chaque bactérie se divise en 2 en transmettant la mutation. À l’inverse, si elle se produit vers la fin de la culture, lorsqu’il y a un grand nombre de bactéries — ce qui est davantage probable —, il y aura peu de bactéries résistantes car elles n’auront pas beaucoup de temps pour se diviser. Donc, dans ce second cas, si l’on considère plusieurs cultures séparées, on devrait avoir :

  • un petit nombre de cultures avec un nombre de bactéries résistantes au virus bien supérieur à la moyenne, si la mutation est apparue tôt ;
  • un grand nombre de cultures avec un petit nombre de bactéries résistantes, si la mutation est apparue plus tard.

L’article compare cette situation à celle rencontrée avec les machines à sous : très souvent, au final vous récoltez moins d’argent que vous n’en avez misé ; mais exceptionnellement, le gain remporté sera très élevé : c’est le jackpot ! Les mutations, c’est l’argent gagné !

Ce modèle de la « machine à sous » montre que si l’hypothèse mutationnelle est vérifiée, la variabilité du nombre de bactéries résistantes entre les cultures devrait donc être beaucoup plus grande que si c’est l’hypothèse d’immunité héréditaire acquise qui est vérifiée. Le raisonnement des chercheurs leur permet alors de prédire l’ampleur de la variabilité du nombre de bactéries attendues en fonction de chaque hypothèse (Figure 3). Ne reste plus qu’à expérimenter pour le tester.

Figure 4. Représentation schématique de l’apparition des mutations pendant la division cellulaire, ici sur trois générations, en fonction de l’hypothèse considérée. Chaque arbre représente une expérience différente. Chaque nœud de l’arbre représente une bactérie. La division d’une bactérie est représentée comme un nouvel embranchement créant deux bactéries-filles. Selon l’hypothèse mutationnelle, le nombre de mutants devrait être variable d’une culture à l’autre, en fonction du moment d’apparition de la mutation. Selon l’hypothèse d’immunité acquise, le nombre de mutants devrait être stable entre les cultures.

C’est l’heure de jouer !

Concrètement, les chercheurs ont utilisé la bactérie Escherichia coli (E. coli) — déjà bien connue et caractérisée [1] — et le phage α, qui sera plus tard renommé phage T1 par Delbrück lui-même.

Les volumes et milieux de culture peuvent varier d’une expérience à l’autre. Aussi, pour s’assurer que les expériences sont robustes, des cultures bactériennes sont réalisées en double dans les mêmes conditions et le même jour : ce sont des cultures parallèles. À plusieurs reprises, les auteurs de la publication ont laissé croître entre cinq et cent cultures parallèles d’E. coli jusqu’à saturation. Ils ont ensuite étalé la culture sur un milieu de culture solide, en présence d’une grande quantité de phages (Figure 4). 24 ou 48 heures après étalement, ils comptent les clones maintenant visibles à l’œil nu sur le milieu, et qui sont tous issus de bactéries résistantes au phage (Figure 4). Le nombre de clones correspond donc au nombre de bactéries résistantes au moment de l’ajout des phages.

Figure 5. Des bactéries mises en contact avec des phages, sur milieu solide. Sur 10 à 100 millions de bactéries, quelques centaines se sont révélées résistantes : les clones issus de ces bactéries sont visibles sur le milieu. Les autres ont été lysées, et ne sont donc pas visibles. Expérience réalisée dans le laboratoire Bactériophages de bactéries Gram-positives de l’I2BC (CNRS).

À partir du nombre de bactéries résistantes au phage présentes sur chaque boîte, ils peuvent calculer la moyenne et la variabilité du nombre de bactéries sur une expérience. Surprise : la variabilité des résultats observée est bien plus grande que celle qu’ils avaient prédite pour l’hypothèse mutationnelle

Pour eux, cette importante variation du nombre de mutants va à l’encontre de l’hypothèse d’immunité acquise. Ces résultats confirment donc l’hypothèse mutationnelle.

À travers ces expériences, Luria et Delbrück montrent que la résistance de leurs bactéries à ce phage est une mutation héritable, dont l’apparition et la transmission sont indépendantes de l’action du phage lui-même.

Pour la première fois, une estimation du taux de mutation

À la fin de leur article, Luria et Delbrück appliquent deux méthodes différentes pour estimer le taux de mutation, c’est-à-dire la probabilité qu’une bactérie E.coli devienne résistante au virus T1

Ils trouvent un taux de mutation moyen d’environ 10-8 mutations par cellule et par génération, avec peu de variations d’une expérience à l’autre. Il y a donc environ une chance sur 40 millions pour que, lors d’une division cellulaire, la cellule-fille devienne résistante au phage. Leurs expériences montrent également que le milieu et le volume de culture, ainsi que le nombre de cultures parallèles au sein d’une même expérience n’apporte pas de différence significative au taux de mutation.

L’héritage de Luria et Delbrück

Outre une démonstration que « la mutation précède la sélection » et non l’inverse, Luria et Delbrück ont aussi développé un protocole expérimental qui a fait date. Le protocole qu’ils ont mis en œuvre, appelé par la suite le test de fluctuation, est encore utilisé de nos jours pour estimer le taux de mutation d’un organisme, même si de nouveaux modèles mathématiques permettent de l’estimer de manière plus fiable.

D’autres pressions de sélection peuvent aussi être appliquées. Par exemple, les bactéries peuvent également acquérir des mutations qui leur permettent de résister à un antibiotique. Il est alors possible d’effectuer le test de fluctuation en étalant les bactéries non pas sur du milieu contenant des phages, mais sur du milieu contenant des antibiotiques.

L’avènement des techniques de séquençage du génome complet — qui permettent de lire l’intégralité de l’information génétique d’un organisme — a également fait naître de nouveaux protocoles pour estimer des taux de mutation.

Les mécanismes qui se produisent dans la bactérie et qui conduisent à la résistance au phage T1 ont également été élucidés. Les mutations se produisent sur des gènes codant pour des protéines placées sur la membrane cellulaire — à la frontière entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule — qui sont bien pratiques pour importer, par exemple, du fer dans la cellule, mais servent également de récepteur à différents phages, dont le phage T1.

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[1] Blount Z. D., The unexhausted potential of E. coli.eLife, 2015. DOI : 10.7554/eLife.05826 

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Creative Commons License
Irène Tanneur/Papier-Mâché/CC BY 4.0

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